H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR及装甲RNA标准物质的研究和应用

【摘要】A型流感病毒是引起人和动物流感流行的主要病原,H1和H3亚型流感病毒是A型流感病毒中感染宿主范围最广、流行面积最大和危害最为严重的两种病毒。实时荧光RT-PCR是A型流感病毒检测和亚型鉴定的一种主要技术,相继被世界卫生组织(WHO)推荐用于2009年甲型H1N1流感和2013年人感染H7N9禽流感病毒的检测。在我国,实时荧光RT-PCR也被应用于H5、H7、H9等亚型以及A型流感病毒通用检测中,并制定了相应的国家标准。本研究立足于我国尚缺乏针对H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的国家标准,开展了相关研究。同时,采用噬菌体装甲RNA技术,研制了流感病毒的新型核酸标准物质,为流感病毒核酸检测技术的质量控制奠定了物质基础。1.H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的建立在对A型流感病毒属病毒株序列比对的基础上,分别针对H1和H3亚型HA基因设计引物和LNA或MGB修饰的TaqMan短探针。在对引物、探针进行筛选和反应条件优化的基础上,分别建立了H1和H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法。特异性试验表明,H1亚型流感病毒实时荧光RT-PCR可有效用于不同宿主来源和基因型毒株的检测,包括H1亚型人季节性流感病毒、古典H1N1猪流感病毒、类禽H1N1猪流感病毒和甲型H1N1流感病毒(2009)；H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR可有效用于不同宿主来源毒株的检测,包括H3N8马流感病毒、H3亚型禽流感病毒和猪流感病毒；且两种方法与其他亚型流感病毒和动物病毒均无交叉反应。灵敏性试验结果表明,H1和H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR对体外转录cRNA标准品检测极限分别为46和69拷贝/反应；重复性试验中,2种方法对含不同病毒核酸拷贝数样品重复检测3次,其Ct值的变异系数均小于5%。将2种方法应用于612份临床送检组织和拭子样品的检测,并与国家标准规定的普通RT-PCR进行比对,结果符合率均在95%以上,且本研究建立的方法比普通RT-PCR方法灵敏度高10倍和100倍。2.H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法国家标准的起草和验证在2种实时荧光RT-PCR技术建立的基础上,申请获得了国家标准立项,完成操作过程的标准化研究,起草了《动物流感检测H1亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法》和《动物流感检测H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法》2项国家标准草案,明确规定了样品采集与前处理程序、样品核酸提取程序、荧光RT-PCR反应体系配制与加样程序、反应参数设置、结果判定原则、引物序列和探针序列等技术内容。2项标准草案在国内13家实验室对合计1519份临床样品验证的基础上,征求13家科研单位的意见形成送审稿。3.内含A型流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒的构建和表达为构建流感病毒新型装甲RNA核酸质控品,将MS2噬菌体成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点以及流感病毒M基因克隆于表达载体pET32a中,经原核表达后,利用Cellufinesulfate层析柱纯化,经RT-PCR和实时荧光RT-PCR鉴定后研制了包装有流感病毒M基因的装甲RNA(Armored-M,AR-M)病毒样颗粒。稳定性研究表明,AR-M可耐受RNase的降解,且在-20℃和4℃至少可保存3个月以上。AR-M用作流感病毒核酸检测质控样品,具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性,将其用作动物A型流感病毒核酸检测质控品可实现对检测全过程的质量控制。4.A型流感病毒核酸检测装甲RNA标准物质的研制将包装有流感病毒M基因RNA的病毒样颗粒,经A型流感病毒通用荧光RT-PCR定值后,制备了流感病毒核酸检测的标准物质。均匀性试验表明病毒样颗粒分布均匀,随机抽取的10管标准物质变异系数小于5%；稳定性试验证实装甲RNA标准物质非常稳定,在室温、2-8℃、-20℃分别可保存14天、3个月和6个月以上；经协作标定及不确定度分析,表明该标准物质的不确定度为0.34×106Copies/μL,含量定值为(3.54±0.34)x106Copies/μL,可实现待检样品的定量分析。流感病毒装甲RNA标准物质的推广应用,将为流感病毒核酸检测工作提供统一的、具有可比性的标准物质。综上所述,本研究建立了H1和H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法,进而形成了相应的国家标准送审稿。同时,利用噬菌体病毒包装技术,构建了内含流感病毒核酸的装甲RNA标准物质。本研究制定的国家标准和研制的标准物质,将为流感病毒核酸检测技术的规范化使用提供重要的指导和保障。
【作者】乔彩霞；
【导师】刘金华；张鹤晓；
【作者基本信息】中国农业大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】H1亚型流感病毒；H3亚型流感病毒；荧光RT-PCR；装甲RNA；标准物质；

【参考文献】
[1]凌飞龙.SAR图像去噪及多源遥感数据融合算法研究[D].福州大学,环境工程,2004,硕士.
[2]刘国珍.突围与自困：《围城》中的两位女性知识分子[D].吉林大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[3]李亚昆.三维动画及运动仿真技术的研究[D].大连理工大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[4]高倩.论行政权与审判权的关系[D].甘肃政法学院,法律,2012,硕士.
[5]刘旭龙.京津冀区域机场系统协调发展研究[D].河北大学,政治经济学,2014,硕士.
[6]马珍珍.大型客机供应商质量管理流程优化及绩效评价研究[D].南京航空航天大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[7]纪宏菲.《二十四诗品》之“以诗论诗”论[D].牡丹江师范学院,文艺学,2012,硕士.
[8]李传常.矿物基复合储热材料的制备与性能调控[D].中南大学,材料科学与工程,2013,博士.
[9]李娟.发芽糙米蒸煮性能改善研究[D].中南林业科技大学,林业工程,2012,硕士.
[10]夏倩.浏阳市县域经济发展战略研究[D].中南林业科技大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[11]王云红.3-烷氧基水杨醛希夫碱镍基簇合物的过程转变及钴镍混金属掺杂模式的探究[D].西北大学,无机化学,2013,硕士.
[12]何清.MCA血流参数对早产儿颅内出血的评估价值[D].遵义医学院,儿科学（专业学位）,2014,硕士.
[13]赵文强.地理信息技术支持下的地理教学模式创新研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[14]张爱红.马克思地租理论与我国农村土地制度改革研究[D].西北师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[15]王淼.苦参碱磷脂复合物眼用原位凝胶给药系统的研究[D].成都中医药大学,药剂学,2012,硕士.
[16]吴炜.基于机器视觉的纸币印刷缺陷检测系统[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[17]黄卓,王文峰,郭波.连续PH分布数据拟合的确定性退火EM算法[J].控制与决策,2008,02:133-139.
[18]刘鹏,雷蕾,张雪凤.缺失数据处理方法的比较研究[J].计算机科学,2004,10:155-156+174.
[19]曹雪峰.兔VX2肝移植瘤MR灌注成像与MVD及VEGF的相关性研究[D].川北医学院,影像医学与核医学,2013,硕士.
[20]丛树铮,RicardoHarboe,GertA.schultz.多站暴雨资料综合统计方法的研究[J].水文.1984(02)
[21]管卫.胸部数字化X线影像（DR）中肺部小结节的自动检测技术及临床应用探讨[D].浙江大学,生物医学工程,2004,硕士.
[22]林涛.网上证券交易法律问题研究[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.
[23]黄琳.基于宜居性的现代住区植物景观营造模式研究[D].西安建筑科技大学,艺术设计,2013,硕士.
[24]王海霞.NEDD9在上皮性卵巢癌恶性生物学行为中的作用及机制的初步研究[D].重庆医科大学,妇产科学（专业学位）,2014,博士.
[25]朱江婷.β-内啡肽及其受体在增生性瘢痕感觉异常发生中的分子机制及相关研究[D].南方医科大学,整形外科学,2012,硕士.
[26]周子力.广金钱草中三种黄酮碳苷的制备与含量测定[D].西南交通大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[27]申慧慧.贵州省生产性服务业发展研究[D].贵州财经大学,产业经济学,2013,硕士.
[28]孙红琼.彝文句法结构分析[D].上海师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[29]马彪.回溯推理理论在刑事侦查中的运用[D].西南政法大学,法律逻辑学,2012,硕士.
[30]赵跃宏.影响产后盆底功能障碍产科因素的前瞻性研究[D].南方医科大学,围产医学（专业学位）,2014,博士.
[31]赵群,习霞,明亮.电化学还原石墨烯修饰电极测定酱油中铅含量[J].中国调味品,2013,10:81-83.
[32]段鋆.大跨径钢管混凝土拱桥扣挂系统研究[D].重庆交通大学,防灾减灾工程及防护工程,2012,硕士.
[33]郑艳.合并对价分摊中的无形资产评估研究[D].北京交通大学,2013.
[34]刘婧.家长主义诉讼观的兴衰及其现代启示[D].苏州大学,诉讼法学,2014,硕士.
[35]谢攀,甄一松,张利,张利,惠汝太.蛋白与蛋白相互作用研究的生物信息学进展[J].中国分子心脏病学杂志,2002,05:54-59.
[36]孙兰英.基于WEB具有动画功能画法几何课件的开发[D].华北电力大学（河北）,机械工程,2004,硕士.
[37]罗晋军.葛洲坝500kV直流换流站谐波测试与分析[D].重庆大学,电气工程,2003,硕士.
[38]朱莺娇.经照射的单倍体相合供者淋巴细胞输注抗小鼠黑色素瘤的效应研究[D].福建医科大学,肿瘤学,2014,硕士.
[39]胡凤莉.中药药效成分分析中的色谱新方法研究[D].复旦大学,2009.
[40]白春河.侧边抛磨光纤传输特性的实验研究[D].兰州大学,计算机技术,2012,硕士.
[41]娜达莉娅.母语为俄语的留学生初级汉语声调偏误及教学对策[D].北京外国语大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[42]贺绍栋.小学教师课程权力行使困境及对策研究[D].南京师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[43]王慎中.石油部石油物探专业教学改革座谈会河北省涿州市召开[J].石油地球物理勘探,1987,03:268.
[44]梅卫明.光纤光缆企业实施客户关系管理策略探讨[D].西南财经大学,2005.
[45]许奇,毛保华,李明高,冯旭杰.基于自适应Agent的地铁站台乘客集散仿真研究[J].交通运输系统工程与信息,2014,01:28-33+46.
[46]刘亚东.基于眼三针对动眼神经麻痹时效关系的临床研究[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[47]智会强.神经网络和遗传算法在导热反问题中的应用[D].河北工业大学,热能工程,2004,硕士.
[48]孙更新.嵌入式动态可配置实时操作系统HDC-ReOS的研制——进程管理[D].青岛大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[49]王玉镯.甘肃省青少年中长跑后备人才培养现状研究[D].西北师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[50]解欢.斯特林发动机活塞杆帽式密封性能相关问题研究[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.